Cymhariaeth o Dechnegau Microsgopeg Cydraniad Uwch Gwahanol
Ar gyfer microsgopeg golau confensiynol, mae diffreithiant golau yn cyfyngu cydraniad delweddu i tua 250 nm. Heddiw, gall technegau uwch-datrysiad wella hyn gan fwy na ffactor o 10. Cyflawnir y dechneg hon yn bennaf trwy dri dull: microsgopeg lleoleiddio moleciwl sengl, gan gynnwys microsgopeg lleoleiddio ffotosensitif (PALM) a microsgopeg ail-greu optegol stochastig (STORM); microsgopeg goleuo strwythuredig (SIM); a microsgopeg dihysbyddu allyriadau ysgogol (STED). Sut i ddewis technoleg cydraniad uwch yw'r hyn y mae pawb yn poeni amdano. “Yn anffodus, nid oes unrhyw egwyddorion syml ar gyfer penderfynu pa ddull i’w ddefnyddio,” meddai Mathew Stracy, ymchwilydd ôl-ddoethurol ym Mhrifysgol Rhydychen, y DU. "Mae gan bob un ei fanteision a'i anfanteision ei hun." Wrth gwrs, mae gwyddonwyr hefyd yn darganfod sut i ddewis y dull cywir ar gyfer prosiect penodol. "Yng nghyd-destun bioddelweddu, mae'r ffactorau allweddol i'w hystyried yn cynnwys: cydraniad gofodol ac amser, sensitifrwydd i ddifrod ffoto, gallu labelu, trwch sampl, a fflworoleuedd cefndirol neu Fflworoleuedd awtologaidd celloedd." Sut mae'n gweithio Mae'r microsgopau cydraniad uwch amrywiol yn gweithio mewn gwahanol ffyrdd. Yn achos PALM a STORM, dim ond cyfran fach o farcwyr fflwroleuol sy'n cael eu cyffroi neu eu llun-actifadu ar adeg benodol, gan alluogi eu lleoleiddio annibynnol yn fanwl iawn. Mae mynd trwy'r broses hon gyda'r holl labeli fflwroleuol yn arwain at ddelwedd cydraniad uwch gyflawn. Dywedodd Stefan Hell, un o enillwyr Gwobr Nobel mewn Cemeg 2014 a chyfarwyddwr Sefydliad Cemeg Bioffisegol Max Planck: “Mae’r system PALM/STORM yn gymharol hawdd i’w sefydlu, ond mae’n anodd ei chymhwyso, oherwydd mae’r system fflwroleuol. rhaid i'r grŵp allu ffotoactivation. Cyfyngiadau Yr anfantais yw bod angen iddynt ganfod un moleciwl fflwroleuol yng nghyd-destun cell, ac maent yn llai dibynadwy na STED." Mae STED yn defnyddio pwls laser i gyffroi'r fflworoffor a laser siâp cylch i ddiffodd y fflworoffor, gan adael fflworoleuedd maint nanomedr canolradd yn unig ar gyfer cydraniad uwch. Mae sganio'r sampl gyfan yn cynhyrchu delwedd. “Mantais STED yw ei fod yn dechnoleg botwm gwthio,” esboniodd Hell. "Mae'n gweithio fel microsgop fflworoleuedd confocal safonol." Gall hefyd ddelweddu celloedd byw gan ddefnyddio fflworofforau fel proteinau fflwroleuol gwyrdd neu felyn a llifynnau sy'n deillio o rhodamine. Cymhariaeth barametrig Er bod yr holl dechnegau cydraniad uwch yn rhagori ar ficrosgopeg golau confensiynol o ran cydraniad, maent yn wahanol i'w gilydd. Mae SIM yn dyblu'r cydraniad yn fras i tua 100 nm. Gall PALM a STORM ddatrys targedau 15 nm. Yn ôl Hell, mae STED yn darparu datrysiad gofodol o 30 nm mewn celloedd byw a 15 nm mewn celloedd sefydlog. O ran cymwysiadau penodol, rhaid inni hefyd ystyried y gymhareb signal-i-sŵn. Mewn rhai achosion, gall cydraniad is ond SNR uwch arwain at ddelwedd well na'r gwrthwyneb (cydraniad uwch ond SNR is). Mae cyflymder caffael delwedd hefyd yn bwysig iawn, yn enwedig ar gyfer celloedd byw. "Mae'r holl dechnegau cydraniad uwch yn arafach na thechnegau delweddu fflworoleuedd confensiynol," meddai Stracy. "PALM/STORM yw'r arafaf, mae angen degau o filoedd o fframiau i gael un ddelwedd, mae angen dwsinau o fframiau ar SIM, ac mae STED yn dechnoleg sganio, felly mae'r cyflymder caffael yn dibynnu ar faint y maes golygfa." Yn ogystal â chelloedd byw neu gelloedd Delweddu sefydlog, mae rhai gwyddonwyr hefyd eisiau deall sut mae gwrthrychau'n symud. Mae gan Stracy ddiddordeb mewn deall deinameg systemau biolegol mewn celloedd byw, nid delweddau statig yn unig. Mae'n cyfuno PALM ag olrhain gronynnau sengl i ddadansoddi dynameg mewn celloedd byw. Yn y modd hwn, gall olrhain y moleciwlau marcio yn uniongyrchol wrth iddynt gyflawni eu swyddogaethau. Fodd bynnag, mae'n credu nad yw SIM yn addas ar gyfer astudio'r prosesau deinamig hyn ar y lefel foleciwlaidd, ond oherwydd ei gyflymder caffael cyflym, mae'n arbennig o addas ar gyfer arsylwi dynameg strwythurau mwy, megis cromosomau cyfan. Y canlyniadau diweddaraf Yn 2017, adroddodd tîm Hell y microsgop cydraniad uwch-MINFLUX mewn Gwyddoniaeth. Yn ôl Uffern, mae'r dull uwch-ddatrysiad hwn yn cyflawni cydraniad gofodol o 1 nm am y tro cyntaf. Yn ogystal, gall olrhain moleciwlau unigol mewn celloedd byw o leiaf 100 gwaith yn gyflymach na dulliau eraill. Roedd gwyddonwyr eraill hefyd yn canmol y microsgop MINDLUX. “Mae cymwysiadau a dulliau newydd yn cael eu datblygu’n gyson, ond mae dau ddatblygiad yn sefyll allan i mi,” meddai Shechtman. Mae un yn MINFLLUX. "Mae'n defnyddio dull dyfeisgar i gael lleoliad moleciwlaidd manwl iawn." O ran yr ail ddatblygiad cyffrous, soniodd Shechtman am WE Moerner a'i gydweithwyr ym Mhrifysgol Stanford. Roedd Moerner hefyd wedi derbyn Gwobr Nobel 2014 mewn Cemeg. Un o'r enillwyr. Er mwyn mynd i'r afael â chyfyngiad datrysiad delweddu a achosir gan wasgariad anisotropig moleciwlau sengl fflwroleuol, defnyddiodd y gwyddonwyr wahanol bolareiddiadau cyffroi i bennu cyfeiriadedd a lleoliad y moleciwlau. Yn ogystal, maent wedi datblygu arwynebau disgyblion cain. Mae'r technegau hyn yn gwella'r gallu i leoleiddio strwythurau. Ynglŷn â labeli fflwroleuol Mewn llawer o gymwysiadau cydraniad uwch, mae labeli'n bwysig iawn. Mae yna hefyd rai cwmnïau sy'n darparu cynhyrchion cysylltiedig. Er enghraifft, mae Miltenyi o'r Almaen wedi ymuno ag Abberior, cwmni a sefydlwyd gan Stefan Hell, i ddarparu gwasanaethau cydgysylltiad gwrthgyrff wedi'u teilwra ar gyfer llifynnau microsgopeg cydraniad uwch. Mae nifer o gwmnïau eraill hefyd yn cynnig marcwyr paru. “Mae ein Nano-Boosters yn fach iawn, dim ond 1.5 kDa, ac yn benodol iawn,” meddai Christoph Eckert, swyddog marchnata yn ChromoTek. Mae'r proteinau hyn yn rhwymo proteinau fflwroleuol gwyrdd a choch (GFP a RFP). Maent yn deillio o ddarnau gwrthgorff alpaca, a elwir yn VHH neu nanobodies, gydag eiddo rhwymo rhagorol ac ansawdd sefydlog heb amrywiad swp-i-swp. Mae'r marcwyr hyn yn addas ar gyfer amrywiol dechnegau cydraniad uwch gan gynnwys SIM, PALM, STORM a STED. Defnyddiodd Ai-Hui Tang, athro cynorthwyol yn Ysgol Feddygaeth Prifysgol Maryland, a chydweithwyr GFP-Booster ChromoTek a STORM i archwilio lluosogi gwybodaeth yn y system nerfol. Daethant o hyd i nanoclwstrau moleciwlaidd, a elwir yn nanocolofnau, mewn niwronau presynaptig ac postynaptig. Mae'r gwyddonwyr yn credu bod y strwythur hwn yn dangos bod y system nerfol ganolog yn defnyddio egwyddorion syml i gynnal a rheoleiddio effeithlonrwydd synaptig. Mae fersiynau amrywiol o ddelweddu cydraniad uwch a nifer cynyddol o ddulliau yn mynd â gwyddonwyr hyd yn oed yn ddyfnach i ddirgelion biolegol. Trwy dorri terfyn diffreithiant golau gweladwy, gall biolegwyr hyd yn oed "fonitro'n agos" gweithredoedd celloedd.
