Nodweddion technegol a sgiliau defnyddio microsgop fflworoleuedd dau ffoton
Mae microsgopeg fflworoleuedd dau ffoton yn dechnoleg newydd sy'n cyfuno microsgopeg confocal sganio laser a thechnoleg cyffroi dau ffoton.
Egwyddor sylfaenol cyffro dau ffoton yw: yn achos dwysedd ffoton uchel, gall moleciwlau fflwroleuol amsugno dau ffoton tonfedd hir ar yr un pryd, ac allyrru ffoton tonfedd fyrrach ar ôl cyfnod byr o oes cyflwr cyffrous fel y'i gelwir. . ; Mae'r effaith yr un fath â defnyddio ffoton â thonfedd hanner y donfedd hir i gyffroi moleciwl fflwroleuol. Mae cyffro dau ffoton yn gofyn am ddwysedd ffoton uchel. Er mwyn peidio â difrodi celloedd, mae microsgopeg dau ffoton yn defnyddio laserau pwls ynni uchel wedi'u cloi â modd. Mae gan y laser a allyrrir gan y laser hwn ynni brig uchel ac ynni cyfartalog isel, dim ond 100 femtoseconds yw ei led pwls, a gall ei gyfnod gyrraedd 80 i 100 megahertz. Wrth ddefnyddio lens gwrthrychol agorfa rifiadol uchel i ganolbwyntio ffotonau'r laser pwls, y dwysedd ffoton ym mhwynt ffocws y lens gwrthrychol yw'r uchaf, ac mae'r cyffro dau ffoton yn digwydd ar ganolbwynt y lens gwrthrychol yn unig, felly nid oes angen twll pin confocal ar y microsgop dau ffoton, sy'n gwella effeithlonrwydd canfod Fflworoleuedd. Mae'n ddull ymchwil pwysig ym meysydd morffoleg, bioleg celloedd moleciwlaidd, niwrowyddoniaeth, a ffarmacoleg.
1. Cefndir ymddangosiad microsgopeg dau ffoton - dau gyfyngiad microsgopeg confocal laser traddodiadol:
1) Un yw'r ffenomen ffotowenwyndra: oherwydd mae'n rhaid i'r twll pin confocal fod yn ddigon bach i gael delwedd cydraniad uchel, a bydd yr agorfa fach yn rhwystro rhan fawr o'r fflworoleuedd a allyrrir o'r sampl, gan gynnwys y fflworoleuedd a allyrrir o'r awyren ffocal, yr Ie cyfatebol, rhaid i'r golau cyffroi fod yn ddigon cryf i gael cymhareb signal-i-sŵn digonol; a bydd y laser dwysedd uchel yn achosi i'r llifyn fflwroleuol bylu'n gyflym yn ystod sganio parhaus, a bydd y signal fflwroleuol yn mynd yn wannach ac yn wannach wrth i'r sganio fynd rhagddo.
2) Mae ffotowenwyndra yn broblem arall. O dan arbelydru laser, bydd llawer o foleciwlau llifyn fflwroleuol yn cynhyrchu cytotocsinau fel ocsigen singlet neu radicalau rhydd, felly dylid cyfyngu'r amser sganio a dwysedd pŵer optegol y golau excitation yn yr arbrawf i gynnal dwysedd y sampl. gweithgar. Yn yr ymchwil ar samplau gweithredol, yn enwedig y gwahanol gamau o dwf a datblygiad samplau gweithredol, mae ffotobleaching a ffotowenwyndra yn gwneud yr astudiaethau hyn yn gyfyngedig iawn.
2. Pam ydych chi'n dweud nad oes angen i ficrosgopau dau ffoton fod â laserau excitation uwchfioled yn gyffredinol?
Mae microsgopeg dau ffoton yn dechnoleg excitation fflworoleuedd sy'n seiliedig ar effaith cyffro dau ffoton: gall moleciwlau llifyn fflwroleuol gael eu cyffroi trwy amsugno dau ffoton ynni isel ar yr un pryd (mae'r cyfnod amser rhwng dau ffoton yn cyrraedd moleciwlau fflwroleuol yn llai nag 1 femtosecond ), gall ei effaith excitation fod yn gyfwerth ag amsugno ffoton ynni uchel o 1/2 donfedd. Er enghraifft, mae amsugno dau ffoton ar donfeddi coch yn cyfateb i foleciwl sy'n amsugno uwchfioled. Nid yw celloedd yn amsugno ffotonau tonfedd hir yn hawdd, felly mae ffotowenwyndra i gelloedd byw yn cael ei leihau, ac mae ffotobleaching hefyd yn cael ei leihau. Yn y modd hwn, mae nid yn unig yn chwarae swyddogaeth excitation uwchfioled, ond hefyd yn osgoi difrod golau uwchfioled i'r sampl.
3. Beth sy'n arbennig am y laser o ficrosgop dau-ffoton?
Mae'r tebygolrwydd o amsugno dau ffoton yn dibynnu ar ba mor agos y mae'r ddau ffoton digwyddiad yn cyd-daro mewn gofod ac amser (rhaid i'r ddau ffoton gyrraedd o fewn 10-18 eiliad). Mae trawsdoriad amsugno dau ffoton yn fach, a dim ond fflworofforau mewn rhanbarthau sydd â fflwcs ffoton mawr sy'n gyffrous. Felly, mae'r rhan fwyaf o'r laserau a ddefnyddir yn laserau saffir titaniwm, a all gyflawni cyflymder sganio picosecond neu femtosecond, ac mae ganddynt bŵer brig uchel iawn a phŵer cyfartalog isel, fel y gellir lleihau neu ddileu ffotobleaching a ffotowenwyndra. Y peth pwysicaf yw darparu dwysedd uchel iawn o ffotonau mewn ystod fach, a all sicrhau cyffro dau ffoton ar yr un pryd.
4. Beth yw manteision excitation dau-ffoton?
1) Cynyddu detholiad y llifyn: amrediad golau cyffro laser y system gydffocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) yw 488nm - 647nm. Mae hyn yn golygu arbrofi gyda llifynnau fflworoleuol UV-cyffrous, ee gyda DAPI , Hoescht. Mae tonfedd cyffro dau ffoton ddwywaith cymaint ag un ffoton, felly gall lliwiau sy'n cael eu cyffroi gan uwchfioled gael eu cyffroi gan olau bron-isgoch.
2) Lleihau ffotobleaching: Oherwydd y gostyngiad mewn ffotobleaching, mae cyfradd llwyddiant arbrofion sy'n defnyddio CFP / YFP ar gyfer trosglwyddo egni cyseiniant fflworoleuedd (FRET) yn cynyddu.
3) Nid oes angen lens gwrthrychol arbennig: O safbwynt caledwedd, nid oes angen cydrannau optegol UV arbennig ar gyffro llifynnau UV-gyffrous gyda thonfedd golau isgoch bron.
4) Gwella'r gymhareb signal-i-sŵn: mae gan y donfedd golau excitation a'r donfedd golau a allyrrir wahaniaeth mawr, sy'n gwella'r gymhareb signal-i-sŵn.
5) Cannu wedi'i leoli i'r canolbwynt: Gan mai dim ond yng nghanol yr amcan y mae cyffro fflworoleuedd yn digwydd, nid oes angen twll pin confocal. Mae hyn yn gwella canfod golau ac mae ffotobleaching yn digwydd yn y canolbwynt yn unig.
6) Haws i dreiddio sbesimenau: Nid yw golau tonfedd isgoch yn cael ei wasgaru'n hawdd gan gelloedd a gall dreiddio i sbesimenau dyfnach.
5. O'i gymharu â microsgopeg confocal sganio laser, beth yw'r gwelliant mwyaf a wneir gan ficrosgopeg dau ffoton?
1) llai o ffotobleaching.
2) Llai o wenwyndra.
3) Nid yw'n hawdd ei wasgaru, ac mae'n haws treiddio samplau trwchus, fel sleisys ymennydd.
