Prif ddull arsylwi microsgop optegol yw arsylwi fflworoleuedd
Ffenomen fflworoleuedd
Mae fflworoleuedd yn cyfeirio at y broses lle mae sylwedd fflwroleuol yn allyrru golau â thonfedd hirach bron ar yr un pryd pan gaiff ei arbelydru â golau o donfedd benodol (Ffigur 1). Pan fydd golau tonfedd benodol (tonfedd cyffro) yn taro moleciwl (fel moleciwl mewn fflworoffor), mae egni'r ffoton yn cael ei amsugno gan electronau'r moleciwl. Nesaf, mae'r electronau'n trawsnewid o gyflwr y ddaear (S0) i lefel egni uwch, sef y cyflwr cynhyrfol (S1'). Gelwir y broses hon yn excitation①. Mae'r electron yn aros yn y cyflwr cynhyrfol am 10-9–10-8 eiliad, pan fydd yr electron yn colli rhywfaint o egni ②. Yn y broses o adael y cyflwr cynhyrfus (S1) a dychwelyd i'r cyflwr daear ③, bydd yr egni sy'n weddill a amsugnir yn ystod y broses excitation yn cael ei ryddhau.
Amser preswylio moleciwl fflwroleuol yn y cyflwr cynhyrfus yw'r oes fflworoleuedd, yn gyffredinol mewn nanoseconds, sy'n nodwedd gynhenid o'r moleciwl fflwroleuol ei hun. Gelwir y dechnoleg delweddu gan ddefnyddio oes fflworoleuedd yn Delweddu Oes Fflworoleuedd (FLIM), a all berfformio mesuriadau swyddogaethol a chywir mwy manwl yn ogystal â delweddu dwyster fflworoleuedd i gael cydffurfiad moleciwlaidd, rhyngweithiadau rhyngfoleciwlaidd, a micro-amgylcheddau moleciwlaidd. gwybodaeth sy'n anodd ei chael gyda delweddu optegol confensiynol.
Nodwedd bwysig arall fflworoleuedd yw symudiad Stokes, sef y gwahaniaeth yn y donfedd rhwng y cyffro a'r brigau allyriadau (Ffigur 2). Fel arfer mae'r donfedd golau allyriadau yn hirach na'r donfedd golau excitation. Mae hyn oherwydd ar ôl i'r sylwedd fflwroleuol gael ei gyffroi a chyn i'r ffoton gael ei ryddhau, bydd yr electronau'n colli rhan o'r egni trwy'r broses ymlacio. Mae sylweddau fflwroleuol gyda sifftiau Stokes mwy yn haws i'w gweld o dan ficrosgop fflworoleuedd.
Microsgopau Fflworoleuedd a Blociau Hidlo Fflworoleuedd
Mae microsgopeg fflworoleuedd yn ficrosgop optegol sy'n defnyddio priodweddau fflworoleuedd i arsylwi a delweddu, ac fe'i defnyddir yn eang mewn bioleg celloedd, niwrobioleg, botaneg, microbioleg, patholeg, geneteg a meysydd eraill. Mae gan ddelweddu fflworoleuedd fanteision sensitifrwydd uchel a phenodoldeb uchel, ac mae'n addas iawn ar gyfer arsylwi dosbarthiad proteinau penodol, organynnau, ac ati mewn meinweoedd a chelloedd, astudio cydleoli a rhyngweithio, ac olrhain bywyd deinamig prosesau fel newidiadau mewn crynodiad ïon.
Nid yw'r rhan fwyaf o foleciwlau mewn celloedd yn fflworoleuol, ac er mwyn eu gweld, rhaid eu labelu'n fflworoleuol. Mae yna lawer o ddulliau o labelu fflwroleuol, y gellir eu labelu'n uniongyrchol (fel defnyddio DAPI i labelu DNA), neu imiwno-staenio gan ddefnyddio priodweddau gwrthgyrff sy'n rhwymo antigen, neu gellir labelu'r protein targed â phroteinau fflwroleuol (fel GFP, gwyrdd protein fflwroleuol), neu rwymo cildroadwy. llifynnau synthetig (fel Fura-2), ac ati.
Ar hyn o bryd, mae'r microsgop fflworoleuedd wedi dod yn offer delweddu safonol amrywiol labordai a llwyfannau delweddu, ac mae'n gynorthwyydd da i'n harbrofion dyddiol. Rhennir microsgopau fflworoleuedd yn bennaf yn dri chategori: microsgopau fflworoleuedd unionsyth (addas i'w rhannu), microsgopau fflworoleuedd gwrthdro (addas ar gyfer celloedd byw, gan ystyried adrannau), microsgopau stereosgopig fflwroleuol (addas ar gyfer sbesimenau mwy, megis planhigion, pysgod sebra (oedolyn / embryo), medaka, organau llygoden/llygoden fawr, ac ati).
Y bloc hidlo fflworoleuedd yw elfen graidd delweddu fflworoleuedd mewn microsgopau. Mae'n cynnwys hidlydd excitation, hidlydd allyriadau a holltwr trawst deucroig. Mae wedi'i osod yn yr olwyn hidlo, fel y Leica DMi8 sydd ag olwyn hidlo safle 6- (Ffigur 3). ). Mae gan wahanol ficrosgopau wahanol safleoedd olwynion, ac mae rhai microsgopau'n defnyddio sleidiau hidlo.
Mae'r bloc hidlo yn chwarae rhan bwysig mewn delweddu fflworoleuedd: mae'r hidlydd excitation yn dewis y golau excitation i gyffroi'r sampl ac yn blocio tonfeddi golau eraill; mae'r golau sy'n mynd trwy'r hidlydd cyffro yn mynd trwy drawstiau deucroig (ei rôl yw adlewyrchu'r golau excitation a throsglwyddo'r fflworoleuedd), Ar ôl myfyrio, mae'n canolbwyntio gan y lens gwrthrychol, wedi'i arbelydru i'r sampl, ac mae'r fflworoleuedd cyfatebol yn gyffrous i allyrru golau. Mae'r golau a allyrrir yn cael ei gasglu gan y lens gwrthrychol, yn mynd trwy'r holltwr trawst deucroig, ac yn cyrraedd yr hidlydd allyriadau. Fel y dangosir yn Ffigur 4: y donfedd cyffro yw 450-490nm, mae'r holltwr trawst deucroig yn adlewyrchu golau yn fyrrach na 510nm, yn trawsyrru golau yn hwy na 510nm, a'r ystod derbyn golau allyrru yw 520-560nm.
Gellir rhannu hidlwyr fflworoleuedd a ddefnyddir yn gyffredin mewn microsgopau fflworoleuedd yn ddau fath: pas hir (LP yn fyr) a phas band (BP yn fyr). Mae'r bandpass fel arfer yn cael ei bennu gan y donfedd ganolog a lled yr egwyl, fel 480/40, sy'n golygu y gellir pasio golau o 460-500nm. Mae hidlwyr llwybr hir, fel 515 LP, yn pasio golau gyda thonfeddi sy'n hwy na 515 nm (Ffigur 5).
Mae gan sylweddau fflwroleuol eu cromlin cyffroi (amsugno) a chromlin allyriadau nodweddiadol, y brig cyffro yw'r donfedd cyffroi delfrydol (effeithlonrwydd cyffro uchel, a all leihau'r egni golau excitation, amddiffyn celloedd a llifynnau), a'r gromlin allyriadau yw'r donfedd fflworoleuedd allyriadau. ystod. Felly, yn yr arbrawf, byddwn yn dewis y donfedd mor agos at y brig excitation â phosibl ar gyfer excitation, ac mae angen i'r ystod derbyn gynnwys y brig allyriadau. Er enghraifft, uchafbwynt cyffro Alexa Fluor 488 yw 500nm, a gellir dewis yr hidlydd excitation o 480/40 yn y microsgop fflworoleuedd.
Gellir gweld manylion y ciwbiau hidlo yn y meddalwedd delweddu microsgop. Mae deall llifynnau a dod o hyd i'r hidlydd sy'n cyfateb orau i'ch sampl yn hanfodol ar gyfer delweddu fflworoleuedd. Mae gwybodaeth sbectrol llifynnau fflwroleuol a phroteinau fflwroleuol wedi'i nodi'n gyffredinol yn y cyfarwyddiadau, a gellir dod o hyd iddi ar-lein hefyd.
Yn ogystal â thonfeddi cyffro ac allyrru stilwyr fflwroleuol, mae angen i'r dewis o flociau hidlo hefyd ystyried a oes cyffro amhenodol ac a oes croesliw ar gyfer samplau â label amryliw. Yn ogystal, mae angen ystyried y ffynhonnell golau fflwroleuol a ddefnyddir. Ar hyn o bryd, mae'r ffynonellau golau fflwroleuol a ddefnyddir yn gyffredin yn cynnwys lampau mercwri, lampau halid metel, a ffynonellau golau LED sydd wedi datblygu'n gyflym yn y blynyddoedd diwethaf. Mae sbectrwm ffynhonnell golau fflwroleuol yn barhaus neu'n amharhaol, a bydd yr egni'n wahanol mewn gwahanol fandiau tonfedd. Mae ffynhonnell golau LED yn dod yn brif ffynhonnell golau microsgop fflworoleuedd yn raddol oherwydd ei fand sbectrol cymharol gul, allbwn ynni mwy sefydlog, bywyd hir, diogelu'r amgylchedd yn fwy diogel a llawer o fanteision eraill.
Yn ogystal â bloc hidlo adeiledig y microsgop, mae yna hefyd olwyn gyflym allanol (Ffigur 7). Cyflymder trosi'r hidlydd wrth ymyl olwyn gyflym allanol Leica yw 27ms, a all wireddu arbrofion aml-liw cyflym, megis delweddu calsiwm cymhareb FRET a Fura2. (Ffig. 8) et al.
Amrywiaeth eang o dechnegau delweddu microsgopeg fflworoleuedd
Er mwyn bodloni gwahanol anghenion delweddu fflworoleuedd, yn ogystal â microsgopau fflworoleuedd, mae amrywiol atebion delweddu microsgopeg fflworoleuedd wedi'u datblygu:
Mae systemau delweddu diffiniad uchel maes eang, megis Leica THUNDER Imager, yn defnyddio technoleg Clirio arloesol Leica i gael gwared ar signalau ymyrraeth awyrennau di-ffocal yn effeithlon yn ystod delweddu, gan gyflwyno delweddau clir a manteision delweddu cyflym;
Mae'r microsgop sganio laser confocal yn defnyddio tyllau pin i ddileu ymyrraeth awyrennau di-ffocal, gwireddu toriad optegol, a chael delweddau manylder uwch a delweddau tri dimensiwn;
Gall microsgopau a nano-microsgopau cydraniad uchel iawn sy'n torri trwy'r terfyn diffreithiant arsylwi strwythurau mân sy'n llai na 200 nm;
System ddelweddu multiphoton gan ddefnyddio'r egwyddor o excitation multiphoton ar gyfer delweddu meinwe trwchus a dwfn in vivo;
Technoleg delweddu dalennau ysgafn gyda chydraniad amser a gofodol uchel, cyflymder delweddu cyflym, cydraniad uchel, ffotowenwyndra isel, yn arbennig o addas ar gyfer ymchwil ar ddatblygiad ac arsylwi deinamig in vivo;
Gall delweddu oes fflworoleuedd (FLIM), nad yw ffactorau megis crynodiad sylweddau fflwroleuol, ffotobleaching, dwyster golau cyffro, ac ati, yn cael ei effeithio gan ffactorau swyddogaethol a chywirach;
Mae Sbectrosgopeg Cydberthynas Fflworoleuedd (FCS) a Sbectrosgopeg Traws-gydberthynas Fflworoleuedd (FCCS), yn mesur rhif moleciwlaidd a chyfernod trylediad moleciwlau fflworoleuol, a thrwy hynny ddadansoddi crynodiad moleciwlaidd, maint moleciwlaidd, gludedd, mudiant moleciwlaidd, rhwymiad moleciwlaidd/datgysylltiad moleciwlaidd, a phriodweddau optegol moleciwlaidd;
Mae Microsgopeg Fflworoleuedd Myfyrio Mewnol Cyfanswm (TIRF), gyda chydraniad echel z hynod o uchel, yn ddelfrydol ar gyfer astudio strwythur moleciwlaidd a dynameg arwynebau cellbilen.
