Prif ddull arsylwi microsgop optegol yw arsylwi fflworoleuedd
Mae fflworoleuedd yn cyfeirio at y broses lle mae sylwedd fflwroleuol yn allyrru golau â thonfedd hirach bron ar yr un pryd pan gaiff ei arbelydru â golau o donfedd benodol (Ffigur 1). Pan fydd golau tonfedd benodol (tonfedd cyffro) yn taro moleciwl, fel y rhai mewn fflworoffor, mae egni'r ffoton yn cael ei amsugno gan electronau'r moleciwl. Nesaf, mae'r electronau'n trawsnewid o gyflwr y ddaear (S0) i lefel egni uwch, sef y cyflwr cynhyrfol (S1'). Gelwir y broses hon yn excitation①. Mae'r electron yn aros yn y cyflwr cynhyrfol am 10-9–10-8 eiliad, pan fydd yr electron yn colli rhywfaint o egni②. Yn ystod y broses o electronau yn gadael y cyflwr cynhyrfus (S1) ac yn dychwelyd i'r cyflwr daear③, mae'r egni sy'n weddill sy'n cael ei amsugno yn ystod y broses gyffro yn cael ei ryddhau.
Amser preswylio'r moleciwl fflwroleuol yn y cyflwr cynhyrfus yw'r oes fflworoleuedd, sydd ar y lefel nanosecond yn gyffredinol, ac mae'n nodwedd gynhenid o'r moleciwl fflwroleuol ei hun. Gelwir Fflworoleuedd Delweddu Oes (FLIM), sy'n defnyddio technoleg delweddu oes fflworoleuedd, yn ddelweddu oes fflworoleuedd (FLIM). Yn ogystal â delweddu dwyster fflworoleuedd, gellir cael mesuriadau swyddogaethol a chywir mwy manwl i gael cydffurfiad moleciwlaidd, rhyngweithiadau rhyngfoleciwlaidd, a micro-amgylchedd moleciwlau. Gwybodaeth sy'n anodd ei chael gyda delweddu optegol confensiynol.
Nodwedd bwysig arall fflworoleuedd yw symudiad Stokes, sef y gwahaniaeth yn y donfedd rhwng y cyffro a'r brigau allyriadau (Ffigur 2). Yn nodweddiadol mae'r donfedd allyriad yn hirach na'r donfedd cyffroi. Mae hyn oherwydd bydd electronau'n colli rhan o'u hegni trwy'r broses ymlacio ar ôl i'r sylwedd fflwroleuol gyffroi a chyn rhyddhau ffotonau. Mae sylweddau fflwroleuol gyda sifftiau Stokes mwy yn haws i'w gweld o dan ficrosgop fflworoleuedd.
Microsgopeg Fflworoleuedd a Chiwbiau Hidlo Fflworoleuedd
Mae microsgop fflworoleuedd yn ficrosgop optegol sy'n defnyddio priodweddau fflworoleuedd ar gyfer arsylwi a delweddu, ac fe'i defnyddir yn eang mewn amrywiol feysydd megis bioleg celloedd, niwrobioleg, botaneg, microbioleg, patholeg a geneteg. Mae gan ddelweddu fflworoleuedd fanteision sensitifrwydd uchel a phenodoldeb uchel, ac mae'n addas iawn ar gyfer arsylwi dosbarthiad proteinau ac organynnau penodol mewn meinweoedd a chelloedd, astudio colocalization a rhyngweithio, olrhain prosesau deinamig bywyd megis newidiadau crynodiad ïon. , etc.
Nid yw'r rhan fwyaf o foleciwlau mewn celloedd yn fflworoleuol, ac i'w gweld rhaid iddynt gael eu labelu'n fflworoleuol. Mae yna lawer o ddulliau o labelu fflworoleuol, megis labelu uniongyrchol (fel defnyddio DAPI i labelu DNA), neu imiwneiddio gan ddefnyddio priodweddau rhwymo antigen gwrthgyrff, neu ddefnyddio proteinau fflwroleuol (fel GFP, protein fflwroleuol gwyrdd) i labelu proteinau targed , a rhwymiad cildroadwy. Lliwiau synthetig (fel Fura-2) ac ati.
Ar hyn o bryd, mae'r microsgop fflworoleuedd wedi dod yn offer delweddu safonol amrywiol labordai a llwyfannau delweddu, ac mae'n gynorthwyydd da ar gyfer ein harbrofion dyddiol. Rhennir microsgopau fflworoleuedd yn bennaf yn dri chategori: microsgopau fflworoleuedd unionsyth (addas ar gyfer sleisio), microsgopau fflworoleuedd gwrthdro (addas ar gyfer celloedd byw, gan ystyried sleisio), stereosgopau fflwroleuol (addas ar gyfer sbesimenau mwy, megis planhigion, pysgod sebra (oedolyn / embryo). ), medaka, organau llygoden/llygoden fawr, ac ati).
Bloc hidlo fflworoleuedd yw elfen graidd delweddu fflworoleuedd microsgop. Mae'n cynnwys tair rhan: hidlydd excitation, hidlydd allyriadau a holltwr trawst deucroig. Mae wedi'i osod yn yr olwyn hidlo. Er enghraifft, mae gan Leica DMi8 olwyn hidlo safle 6- (Ffig. 3 ). Bydd nifer y safleoedd o wahanol olwynion microsgop yn wahanol, ac mae rhai microsgopau'n defnyddio sleidiau bloc hidlo.
Mae'r bloc hidlo yn chwarae rhan bwysig mewn delweddu fflworoleuedd: mae'r hidlydd excitation yn dewis y golau excitation i gyffroi'r sampl, ac yn blocio golau tonfeddi eraill; mae'r golau sy'n mynd trwy'r hidlydd cyffro yn mynd trwy'r drych deucroig (ei swyddogaeth yw adlewyrchu'r golau cyffro a throsglwyddo'r fflworoleuedd), Ar ôl myfyrio, mae'r lens gwrthrychol yn canolbwyntio arno, yn arbelydru'r sampl, ac yn cyffroi'r fflworoleuedd cyfatebol, hynny yw , golau wedi'i allyrru. Mae'r golau a allyrrir yn cael ei gasglu gan y lens gwrthrychol, yn mynd trwy'r holltwr trawst deucroig, ac yn cyrraedd yr hidlydd allyriadau. Fel y dangosir yn Ffigur 4: y donfedd cyffro yw 450-490nm, mae'r drych deucroig yn adlewyrchu golau yn fyrrach na 510nm, yn trawsyrru golau yn hwy na 510nm, ac ystod derbyn y golau a allyrrir yw 520-560nm.
