Delweddu microsgopeg amlffoton: technegau amrywiol ar gyfer delweddu niwronau in vivo
O'i gymharu â'r microsgop fflworoleuedd maes eang un ffoton traddodiadol, mae gan ficrosgopeg amlffoton (MPM) swyddogaethau torri optegol a delweddu dwfn. Yn 2019, Jerome Lecoq et al. trafod technoleg MPM cysylltiedig o dair agwedd: delweddu niwron yn ddwfn yn yr ymennydd, delweddu niwronau enfawr, a delweddu niwronau cyflym.
Er mwyn cysylltu gweithgaredd niwronau ag ymddygiad cymhleth, fel arfer mae angen delweddu niwronau yn y cortecs dwfn, sy'n ei gwneud yn ofynnol i MPM gael y gallu i ddelweddu'n ddwfn. Bydd cynnwrf a golau allyrru yn wasgaredig iawn ac yn cael ei amsugno gan feinwe biolegol, sef y prif ffactor sy'n cyfyngu ar ddyfnder delweddu MPM. Er y gellir datrys y broblem gwasgaru trwy gynyddu dwyster y laser, bydd yn dod â phroblemau eraill, megis llosgi'r sampl, dadffocysu a chyffro Fflwroleuol ger yr wyneb. Y ffordd orau o gynyddu dyfnder delweddu MPM yw defnyddio tonfeddi hirach fel golau cyffroi.
Yn ogystal, ar gyfer delweddu dau ffoton (2P), cyffro fflworoleuedd y tu allan i ffocws a ger yr wyneb yw'r ddau ffactor cyfyngu dyfnder mwyaf, ac ar gyfer delweddu tri ffoton (3P), mae'r ddwy broblem hyn yn cael eu lleihau'n fawr, ond delweddu tri-ffoton oherwydd fflworoleuedd Mae trawstoriad amsugno'r grŵp yn llawer llai na thrawstoriad 2P, felly mae angen egni pwls uwch o ran maint i gael yr un signal fflworoleuedd dwyster â'r un a gyffrowyd gan 2P. Mae microsgopeg 3P swyddogaethol yn fwy heriol na microsgopeg 3P strwythurol, sy'n gofyn am sganio cyflymach er mwyn samplu gweithgaredd niwronaidd mewn pryd; mae angen egni pwls uwch er mwyn casglu digon o signalau o fewn amser aros pob picsel.
Mae ymddygiadau cymhleth yn aml yn cynnwys rhwydweithiau ymennydd mawr gyda chysylltiadau lleol a hirdymor. Er mwyn cysylltu gweithgaredd niwronau ag ymddygiad, mae angen monitro gweithgaredd niwronau mawr iawn a ddosbarthwyd yn eang ar yr un pryd. Mae'r rhwydwaith niwral yn yr ymennydd yn prosesu ysgogiadau sy'n dod i mewn o fewn degau o filieiliadau. Deall y rhwydwaith niwral cyflym hwn Er mwyn astudio deinameg niwronau, mae'n ofynnol bod gan MPM y gallu i ddelweddu niwronau yn gyflym. Gellir rhannu dulliau MPM cyflym yn dechnegau sganio un trawst a thechnegau sganio aml-beam.
Mae technoleg sganio un pelydryn yn galluogi croesi meinwe niwral yn gyflym gyda maes golygfa fawr (FOV)
Wrth ddefnyddio MPM i niwronau delwedd, gall sganio mynediad ar hap - hynny yw, mae'r pelydr laser yn cael ei sganio'n gyflym ar unrhyw bwynt dethol yn y maes golygfa cyfan - sganio'r niwronau o ddiddordeb yn unig, sydd nid yn unig yn osgoi sganio unrhyw ffibrau nerfau heb eu labelu. hefyd gwneud y gorau o amser sganio'r pelydr laser. Gellir cyflawni sganio mynediad ar hap (Ffig. 1) gyda deflector acwsto-optig (AOD), sy'n gweithio trwy fondio trawsddygiadur piezoelectrig â signal amledd radio i grisial addas. Mae'r tonnau acwstig canlyniadol yn achosi gratio mynegai plygiannol cyfnodol, Mae diffreithiant yn digwydd pan fydd pelydr laser yn mynd trwy gratio. Gellir addasu dwyster ac amlder y don sain gan y signal trydanol amledd radio i newid dwyster a chyfeiriad y golau diffreithiedig, fel y gellir gwireddu sganio pwynt mympwyol llorweddol un-dimensiwn trwy ddefnyddio un AOD, a gellir gwireddu 3D. trwy ddefnyddio pâr o AODs wedi'u cyfuno â thechnolegau sganio echelinol eraill sganio mynediad ar hap. Fodd bynnag, mae'r dechneg hon yn sensitif iawn i symudiad y sampl ac yn dueddol o gael arteffactau mudiant. Ar hyn o bryd, mae sganio raster cyflym, hynny yw, sganio cynyddol yn FOV, yn cael ei ddefnyddio'n helaeth oherwydd gall yr algorithm ddatrys yr arteffactau cynnig yn hawdd.
Delweddu dau ffoton yn seiliedig ar AOD o niwronau L2/3 neocortigol mewn vivo[2]
Mae yna lawer o ffyrdd o wireddu sganio raster cyflym, gan ddefnyddio drych dirgrynol ar gyfer sganio 2D cyflym, gan gyfuno drych dirgrynol a lens trydan addasadwy ar gyfer sganio 3D cyflym, ond ni all y lens trydan addasadwy ganolbwyntio'n gyflym i'r cyfeiriad echelinol oherwydd y cyfyngiad o syrthni mecanyddol Gall newid, sy'n effeithio ar gyflymder delweddu, bellach gael ei ddisodli â modulator golau gofodol (SLM).
Mae canolbwyntio o bell hefyd yn fodd o gyflawni delweddu 3D, fel y dangosir yn Ffigur 2. Yn y modiwl LSU, mae'r galfanomedr sganio yn sganio'n llorweddol, ac mae'r modiwl ASU yn cynnwys y lens gwrthrychol L1 a'r drych M, a gwireddir y sganio echelinol trwy addasu sefyllfa M. Gall y dechneg hon nid yn unig gywiro'r aberration optegol a gyflwynwyd gan y lens prif amcan L2, ond hefyd yn galluogi sganio echelinol cyflym. I gael mwy o ddelweddu niwron, gellir ehangu'r FOV trwy addasu dyluniad lens gwrthrychol y microsgop, ond mae'r lens gwrthrychol gyda NA mawr a FOV mawr fel arfer yn drwm ac ni all symud yn gyflym ar gyfer sganio echelinol cyflym, felly mae systemau FOV mawr yn dibynnu ar Telefocus , SLM a lensys modur addasadwy.
Diagram sgematig o system ddelweddu dau ffoton â ffocws o bell[3] Gall technoleg sganio aml-belydr ddelweddu gwahanol leoliadau meinwe niwronau ar yr un pryd
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm ar wahân) safleoedd delweddu (Ffig. 3C,D); ar gyfer rhanbarthau cyfagos, mae fel arfer yn defnyddio trawstiau lluosog o lens un gwrthrychol ar gyfer delweddu (Ffig. 3E, F). Rhaid i'r dechneg sganio aml-beam roi sylw arbennig i'r broblem crosstalk rhwng trawstiau cyffro, y gellir ei datrys trwy ddull gwahanu ffynhonnell ôl-golau neu ddull amlblecsio gofod-amser. Mae'r dull gwahanu ffynhonnell golau post-hoc yn cyfeirio at y defnydd o algorithmau i wahanu'r trawstiau i ddileu crosstalk; mae'r dull amlblecsio amser-gofod yn cyfeirio at y defnydd ar yr un pryd o drawstiau cyffro lluosog, mae corbys pob trawst yn cael eu gohirio mewn amser, fel y gellir gwahanu'r trawstiau unigol sy'n cael eu cyffroi gan wahanol drawstiau dros dro. signal fflwroleuol. Gellir delweddu mwy o niwronau trwy gyflwyno mwy o drawstiau, ond bydd trawstiau lluosog yn cynyddu'r gorgyffwrdd o amser pydredd fflworoleuedd, sy'n cyfyngu ar y gallu i wahaniaethu rhwng ffynonellau signal; ac mae amlblecsio yn cael effaith negyddol ar gyflymder gweithio dyfeisiau electronig. Gofynion uchel; mae angen pŵer laser uwch ar nifer fawr o drawstiau hefyd i gynnal cymhareb signal-i-sŵn bras o un trawst, a all arwain yn hawdd at ddifrod meinwe.
Technoleg Delweddu Ardal Fawr
Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae datblygiad gwahanol dechnolegau MPM wedi ehangu cwmpas ein delweddu o feinwe niwral, gan ganiatáu inni ddelweddu mwy o niwronau yn ddwfn yn yr ymennydd yn gyflymach, sydd wedi hyrwyddo ymchwil niwrowyddoniaeth yn fawr ac wedi ein galluogi i Ennill dealltwriaeth gliriach. o swyddogaeth yr ymennydd.
