Ystafell Ddosbarth Delweddu Microsgopig丨 Cymhwyso Microsgopeg Fflworoleuedd
Mae microsgopeg fflworoleuedd adlewyrchiad mewnol cyflawn (TIRFM) yn dechneg sy'n defnyddio'r don evanescent a gynhyrchir gan belydr golau sy'n ymledu rhwng dau gyfrwng mynegai plygiannol gwahanol i archwilio wyneb celloedd byw â label fflworoleuol. Yn ymarferol, pan fydd pelydr laser digwyddiad yn dod ar draws y rhyngwyneb rhwng y clawr a'r cyfrwng dyfrllyd sy'n cynnwys y celloedd, caiff ei adlewyrchu ar yr ongl gritigol (adlewyrchiad mewnol cyfan). Oherwydd bod egni'r don evanescent yn lleihau'n esbonyddol gyda'r pellter o'r clawr, dim ond fflworofforau o fewn 10 nanometr i'r wyneb (rhwng 10 a 200 nanometr) sy'n cael eu cyffroi gan y don evanescent, tra bod fflworofforau ymhellach i ffwrdd yn ddigyffro i raddau helaeth. Wedi'i effeithio. Felly, mae TIRFM yn arwain at lefelau signal uchel o fflworofforau sydd wedi'u lleoli ger y slip gorchuddio, wedi'u harosod ar gefndir tywyll iawn, gan ddarparu cymhareb signal-i-sŵn ardderchog. Mae cyfyngu eithafol ar ddyfnder cyffro yn ddelfrydol ar gyfer astudio moleciwlau sengl neu gyfansoddiad pilen ac organelle mewn celloedd ymlynol ger wyneb y clawr (gweler Ffigur 8(e)). Gan fod cyffro wedi'i gyfyngu i ranbarthau tenau ger y clawr, mae ffotobleaching a ffotowenwyndra hefyd wedi'u cyfyngu i'r rhanbarthau hyn, gan wneud TIRFM yn un o'r dulliau mwyaf defnyddiol ar gyfer arsylwi hirdymor. Mae'r dechneg wedi dod yn offeryn sylfaenol ar gyfer astudio ystod eang o ffenomenau mewn bioleg celloedd a moleciwlaidd.
Mae Deconvolution yn algorithm sy'n cael ei gymhwyso i set o ddelweddau holl-ffocws a gaffaelwyd ar hyd yr echelin optegol (Z) i wella'r signal ffoton mewn pentwr o ddelweddau ar gyfer awyren delwedd benodol neu awyrennau ffocal lluosog. Rhaid i ficrosgopau fod â gyriannau ffocws modur manwl iawn i warantu caffael delwedd ar gyfnodau wedi'u diffinio'n fanwl rhwng planau ffocws y sampl. Mewn cymhwysiad nodweddiadol (gweler Ffig. 8(dd)), defnyddir y broses ddadgyfnewid i ddad-bluo a thynnu golau allan-o-ffocws o awyren ffocal benodol gan ddefnyddio cyffro fflworoleuedd maes llydan ac allyriad. Y cymhwysiad mwyaf cymhleth yw cymhwyso'r broses ddad-ddarganfod i'r pentwr delwedd cyfan i gynhyrchu golygfeydd rhagamcanol neu fodelau 3D. Mae set o ddelweddau maes llydan a ddefnyddir ar gyfer dad-ddarganfod yn dal uchafswm damcaniaethol y ffotonau a allyrrir gan y sampl. Mae'r broses ddatgonoli yn ailddosbarthu dwyster "aneglur" ffotonau a allyrrir uwchben ac o dan yr awyren ffocal yn ôl i'r awyren wreiddiol. Felly, mae deconvolution yn defnyddio bron pob dwysedd allyriadau sydd ar gael ac yn darparu cyllideb ysgafn optimaidd, gan wneud y dechneg hon yn ddull o ddewis ar gyfer samplau sy'n sensitif iawn i olau.
Defnyddir amrywiad o'r ffenomen trosglwyddo egni cyseiniant ar ficrosgopeg fflworoleuedd, fflworoleuedd neu drosglwyddiad egni cyseiniant Förster (FRET) i gael gwybodaeth amser a gofodol feintiol ar rwymo a rhyngweithiad proteinau, lipidau, ensymau ac asidau niwclëig mewn celloedd byw. Gall FRET ddefnyddio naill ai dechnegau cyflwr cyson neu dechnegau amser-datrysedig, ond mae gan ddelweddu FRET wedi’i datrys gan amser y fantais o fapio pellteroedd rhoddwr-derbyniwr yn fwy manwl gywir. Gellir defnyddio microsgop fflworoleuedd maes llydan safonol gyda hidlwyr cyffroi ac allyrru priodol a chamera sensitif ar gyfer delweddu FRET. Mae biosynhwyryddion sy'n rhyngosod protein neu peptid amgylcheddol sensitif rhwng dau brotein fflwroleuol sy'n berthnasol i FRET yn cael eu defnyddio'n helaeth ar hyn o bryd mewn bioleg celloedd. Mae'r stilwyr hyn yn cael eu delweddu'n hawdd o dan ficrosgopeg fflworoleuedd maes eang gan ddefnyddio technegau FRET allyriadau sensiteiddiedig ynghyd â dadansoddiad cymarebau. Yn ogystal, gall delweddu sbectrol a dadgymysgu llinol gan ddefnyddio microsgopeg confocal sganio laser helpu i fonitro ffenomenau FRET mewn biosynwyryddion a chymwysiadau protein fflwroleuol eraill.
Mae microsgopeg delweddu oes fflworoleuedd (FLIM) yn dechneg soffistigedig sy’n gallu cofnodi ar yr un pryd hyd oes fflworoleuedd a lleoliad gofodol fflworoffor ym mhob lleoliad yn y ddelwedd. Mae'r dull hwn yn darparu mecanwaith i astudio paramedrau amgylcheddol megis pH, crynodiad ïonig, polaredd toddyddion, rhyngweithiadau noncofalent, gludedd, a thensiwn ocsigen mewn celloedd byw sengl ac yn cyflwyno'r data mewn araeau gofodol ac amser. Mae mesuriadau FLIM o oes cyflwr cynhyrfus ar y raddfa nanosecond yn annibynnol ar grynodiadau fflworoffor lleol, effeithiau ffotoblethu, a hyd llwybr (trwch sampl), ond maent yn sensitif i adweithiau cyflwr cynhyrfus megis trosglwyddo egni cyseiniant. Mewn gwirionedd, ystyrir bod cyfuno FLIM â FRET trwy fonitro newidiadau oes rhoddwyr fflwroleuol cyn ac ar ôl trosglwyddo egni cyseiniant yn un o'r ffyrdd gorau o astudio'r ffenomen hon.
Gellir pennu symudedd (cyfernod trylediad traws) macromoleciwlau wedi'u labelu'n fflworoleuol a fflworofforau bach trwy adferiad fflworoleuedd ar ôl techneg ffotobleaching (FRAP). Yn FRAP, mae ardal ddethol fach iawn (ychydig o ficromedrau mewn diamedr) wedi'i goleuo'n ddwys, fel arfer gyda laser, i gynhyrchu ffotobleaching cyflawn o'r fflworoffor yn yr ardal honno. Y canlyniad yw gostyngiad dramatig neu ddinistrio fflworoleuedd. Yn dilyn pwls ffotobleaching, cafodd cyfradd a graddau adferiad dwyster fflworoleuedd mewn rhanbarthau cannu eu monitro fel swyddogaeth amser ar ddwyster cynhyrfu isel i gynhyrchu gwybodaeth am cineteg ailboblogi ac adferiad fflworoffor (Ffigur 9). Mae FRAP fel arfer yn cael ei berfformio gan ddefnyddio EGFP neu broteinau fflwroleuol eraill. Mae technegau ffotoactifadu cysylltiedig yn seiliedig ar fflworofforau cawell synthetig arbennig neu broteinau fflwroleuol swyddogaethol tebyg y gellir eu actifadu gan gorbys byr UV neu fioled. Gellir defnyddio ffotoactivation a FRAP fel technegau cyflenwol i bennu paramedrau symudedd.
Mewn techneg sy'n gysylltiedig â FRAP, a elwir yn golled fflworoleuedd ar ôl ffotobleaching (FLIP), mae rhanbarth fflwroleuol diffiniedig o fewn cell fyw yn cael ei ffotobleachu dro ar ôl tro gan arbelydru dwys. Pe bai'r holl fflworofforau yn gallu tryledu i'r ardal sy'n cael ei ffotoblethu yn ystod y cyfnod amser a fesurwyd, byddai hyn yn arwain at golli signal fflwroleuol yn llwyr ledled y gell. Trwy gyfrifo'r gyfradd y mae fflworoleuedd yn diflannu o'r gell gyfan, gellir pennu symudedd tryledol y fflworoffor targed. Yn ogystal, gall FLIP nodi'n hawdd leoliad a natur unrhyw rwystrau ymledol rhwng adrannau unigol o gelloedd, megis y rhwystr rhwng soma ac axon niwron.
Mae sbectrosgopeg cydberthynas fflworoleuedd (FCS), a ddefnyddir yn bennaf mewn microsgopeg confocal sganio â laser neu ficrosgopeg amlffoton, yn ddull sydd wedi'i gynllunio i bennu gwybodaeth ginetig megis cyfraddau adwaith cemegol, cyfernodau trylediad, Technegau ar gyfer pwysau moleciwlaidd, cyfradd llif a chydgrynhoi. Mewn FCS, mae cyfaint bach (tua un femtomedr; ffocws y laser cyfyngedig â diffreithiant) wedi'i oleuo â pelydr laser â ffocws i gofnodi amrywiadau dwyster fflworoleuedd awtofflworoleuol a achosir gan ddeinameg moleciwlau fflwroleuol fel swyddogaeth amser yn y cyfaint a ddefnyddir gan fflworoleuedd moleciwlau (Ffig. 10). Mae fflworofforau cymharol fach yn tryledu'n gyflym yn y cyfaint goleuedig, gan gynhyrchu pyliau byr o ddwysedd ar hap. I'r gwrthwyneb, mae cyfadeiladau mwy (fflworofforau wedi'u rhwymo i macromoleciwlau) yn symud yn arafach, gan gynhyrchu patrymau dwysedd fflworoleuedd hirach, mwy parhaus sy'n dibynnu ar amser.
Pan fydd strwythurau â label fflwroleuol wedi'u pacio'n ddwys ac yn gorgyffwrdd mewn rhanbarthau penodol o gelloedd byw, mae'n anodd dadansoddi eu dynameg a'u dosbarthiad gofodol. Mae microsgopeg sbot fflworoleuedd (FSM) yn dechneg sy'n gydnaws â bron pob dull delweddu sy'n manteisio ar grynodiadau isel iawn o is-unedau wedi'u labelu'n fflworoleuol, yn lleihau fflworoleuedd y tu allan i ffocws, ac yn gwella gwelededd strwythurau wedi'u labelu a'u dynameg mewn rhanbarthau trwchus. Gweithredir PYDd drwy labelu dim ond ffracsiwn o'r strwythur diddordeb cyfan. Yn yr ystyr hwn, mae PYDd yn debyg i berfformio FCS ar draws yr holl faes golygfa, er ei fod yn rhoi mwy o bwyslais ar batrymau gofodol yn hytrach na dadansoddiad amserol meintiol. Mae microsgopeg sbot fflwroleuol yn arbennig o ddefnyddiol wrth bennu symudedd a chydgasglu elfennau sytosgerbydol fel actin a microtiwbiau mewn celloedd gorfywiog.
Mae microsgopeg disbyddu allyriadau ysgogol (STED) yn dechneg cydraniad uwch sy'n dod i'r amlwg gyda chydraniad gofodol ymhell y tu hwnt i'r terfyn diffreithiant, gan ddefnyddio golau disbyddedig siâp cylch i amgylchynu pelydryn llai o olau cyffroi i gael is-50 nm ar-echel i y penderfyniad. Mae'r dechneg yn dibynnu ar gynhyrfu fflworofforau gyda chorbys laser cydamserol a chorbys STED crwn wedi'u cydlynu'n ofodol sy'n disbyddu'r golau a allyrrir, gan atal fflworoleuedd moleciwlau cynhyrfus o amgylch y ffocws sganio laser. Mae fflworoleuedd a gynhyrchir ar gyrion y fan a'r lle yn cael ei atal, ond nid yng nghanol y fan a'r lle, gan leihau maint y fan fflwroleuol yn sylweddol a chynyddu'r cydraniad yn sylweddol. Mae STED wedi profi i fod yn offeryn defnyddiol ar gyfer canfod celloedd byw cydraniad uchel. Bydd technegau uwch-ddatrysiad eraill sy'n dod i'r amlwg, megis microsgopeg lleoleiddio ffotoweithredol (PALM) a microsgopeg goleuo golau strwythuredig (SIM), hefyd yn dod yn arfau sylfaenol ar gyfer delweddu celloedd byw yn y dyfodol agos.
Mae'r defnydd cynyddol o broteinau fflwroleuol wedi'u hamgodio'n enetig a fflworofforau synthetig uwch ar gyfer delweddu celloedd byw yn agor y drws i ddulliau optegol newydd ar gyfer monitro deinameg amser a pherthnasoedd gofodol. Bellach mae gan ficrosgopyddion set gyflawn o offer i arsylwi a chofnodi data delwedd o brosesau cellog sy'n digwydd dros ystod eang o amserlenni ac ar sawl cydraniad. Gellir arsylwi a chofnodi digwyddiadau arafach yn hawdd gan ddefnyddio microsgopeg confocal sganio â laser, tra gellir cael digwyddiadau cinetig cyflymach gan ddefnyddio technoleg disg nyddu. Yn ogystal, mae microsgopeg amlffoton yn galluogi delweddu dwfn mewn meinweoedd trwchus, ac mae technegau adlewyrchiad mewnol cyflawn yn galluogi archwilio arwynebau pilenni gyda thrachywiredd confocal. Gellir defnyddio dulliau fflworoleuedd uwch, megis FRET, FLIM, FRAP, FCS, PYDd, SIM, PALM, a STED, i fonitro rhyngweithiadau protein-protein mewn cydraniad sy'n aml yn well na'r rhai a ganiateir gan y terfyn diffreithiant. Gyda datblygiadau mewn fflworoffor, microsgop a thechnoleg canfod, bydd byd ehangach yn cael ei ddwyn "dan y microsgop".
